琼脂糖凝胶中DNA的回收DEAE纤维
实验方法原理
从琼脂糖凝胶回收DNA是通过电泳至带正电荷的DEAE-纤维素膜上完成的。这种方法首先利用适当浓度的琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，然后紧靠目的DNA片段条带前方切一裂缝。将一长条DEAE纤维素膜插入裂缝。
实验材料
限制性内切核酸酶DNA样品DNA标准RNA
试剂、试剂盒乙酸铵DEAE高盐洗脱缓冲液DEAE低盐洗脱缓冲液EDTA乙醇凝胶载样缓冲液NaOH酚氯仿醋酸钠TE
仪器、耗材琼脂糖凝胶DEAE纤维素膜手提式长波紫外灯水浴
实验步骤
一、材料
1.缓冲液和溶液
乙酸铵（10mol/L)
DEAE高盐洗脱缓冲液（50mmol/LTris-Cl(pH8.0)，1mol/LNaCI，10mmol/LEDTA(pH8.0)）
DEAE低盐洗脱缓冲液（50mmol/LTris-Cl(pH8.0)，0.15mol/LNaCl，10mmol/LEDTA(pH8.0)）
EDTA(10mmol/L，pH8.0)
乙醇
6X凝胶载样缓冲液
0.5mol/LNaOH
酚:氯仿（1:1，V/V)
醋酸钠（3mol/L，pH5.2)
TE(pH8.0)
2.酶和缓冲液
限制性内切核酸酶
3.凝胶
琼脂糖凝胶，含有0.5μg/ml的EB
4.核酸和寡聚核苷酸
DNA样品
DNA标准
RNA，酵母转运tRNA
5.专用设备
DEAE纤维素膜
手提式长波紫外灯
65℃水浴
二、方法
1.消化一定量DNA以收获至少ng目的片段DNA。用含有0.5μg/mlEB的适当浓度的琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段。用手提式长波紫外灯对目的条带进行定位。
2.用锋利的刀片或剃刀在紧靠目的条带前的凝胶上切一切口，其两边比条带宽约2mm。
3.戴上手套，切一块与切口等宽而比凝胶稍深（1mm)的DEAE纤维素膜。在10mmol/LEDTA(pH8.0)室温浸泡5min后，用0.5mol/LNaOH取代EDTA浸泡以活化DEAE纤维素膜。再次室温5min后，用无菌水冲洗6次。
4.用平头镊子将切口壁撑开，将膜插入裂缝中。取出镊子，使切口闭合，小心勿留气泡。
5.继续电泳（5V/cm)直至DNA条带迁移到膜上。电泳过程中，可以用手提式长波紫外灯（nm)进行跟踪检测。
6.当所有目的DNA离开凝胶被收集到膜上时，切断电流。用平头镊子从凝胶中取出膜，室温下，用5~10mlDEAE低盐缓冲液将膜漂洗一下，以除去膜上的琼脂糖。
7.将膜转移到另一个微量离心管中，加足量的DEAE高盐洗脱缓冲液使膜完全被浸没。轻轻的将膜弄皱或对折，但不要压紧。盖上离心管盖，于65℃温育30min。
8.从膜上洗脱DNA的过程中，对凝胶成像，记录被分离出的条带。
9.步骤7的液体转移到另一微量离心管，再加入足量的DEAE高盐洗脱缓冲液，于65℃温育15min。合并两份DEAE高盐溶液。
10.高盐洗脱液用酚：氯仿抽提一次。水相转移到另一离心管。加入0.2倍体积的10mol/L乙酸铵，2倍体积的4℃乙醇。室温放置10min。用微量离心机室温以最大转速离心10min。用70%乙醇小心洗沉淀。打开离心管几分钟，使乙醇完全挥发。再将DNA重溶到3~5μlTE(pH8.0)。
11.如果需要极纯的DNA(如用于小鼠受精卵的显微注射或培养细胞电穿孔)，可以按照下述方法用乙醇再沉淀DNA。
(1)用μlTE（pH8.0）悬浮DNA，加入25μl3mol/L乙酸钠（pH5.2），用2倍体积的乙醇重新沉淀DNA。
(2)4℃微量离心机最大速度离心5~15min,回收DNA。
(3)70%乙醇小心漂洗沉淀。打开离心管几分钟，使乙醇完全挥发。将DNA溶于3~5μlTE(pH8.0)。
12.通过凝胶电泳对DNA进行定性和定量。将少量（10~50ng)最终制备的DNA片段与10μlTE(pH8.0)混合，加入2μl所需的凝胶载样缓冲液。加样并在适当浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳，以已知量的经用适当限制酶消化的原DNA作为参照物标准和分子质量标准。分离的片段应该与限制酶消化产物中的相应片段同步迁移。仔细检査凝胶，看是否有弱荧光带存在。弱荧光带存在表明有DNA污染。
